在之前的文章中，菌菌带领大家了解了关于中试放大部门生产流程的一些内容，具体可参考耀海生物往期文章《【星耀避坑攻略】中试放大的生产流程》。

　　首先，我们要了解什么是微生物发酵。微生物发酵即是利用微生物在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。

　　发酵工业经历了四个历史阶段，分别是原始发展阶段、传统发酵工业阶段、现代发酵工业阶段和生物技术产业阶段。原始发展阶段多为家庭式作坊，用于酿酒等，不知晓其中原理；传统发酵工艺阶段时人们才逐渐了解发酵现象的本质，生产过程也较为简单，对生产设备的要求不高、规模不大；现代发酵工业阶段对生产技术要求比前面两个阶段要高，生产规模也更大，技术发展速度更快，菌种株的生产能力也大幅提升，此时新产品、新技术、新设备的应用达到了前所未有的程度；最后是生物技术产业阶段，也是目前行业内新兴的科技手段，即利用构建的基因工程菌进行工业生产，来达到实验所需。

　　常规理解中，我们都认为中试放大的本质是在实验室小规模生产工艺路线打通后，采用该工艺在模拟工业化生产的条件下所进行的工艺研究。其实不然，中试放大的作用不仅如此。

　　在询问过中试放大的资深老师后，菌菌得到了如下答案：中试放大是以小试工艺为基础，以商业化生产为目的去设计实验的一个中间部门，有着承上启下的作用。

　　中试放大部门从小试工艺中获得实验方案后，第一批工艺先验证小试的工艺是否可行，按照小试工艺条件进行放大，检测是否能满足商业化生产的需求；第二批及第三批等工艺即需要将小试工艺和商业生产相结合，判断工艺放大中是否有其他因素影响工艺的生产，充分考虑车间设备、环境等因素。若有即对小试工艺进行修订，直至成功实行工艺放大；如修订后商业化生产仍不能顺利进行，中试部门即需要重新制定适合商业化生产的工艺，待符合要求后进行工艺转移。

　　除上述外，中试部门还起着数据积累的作用。每做一批项目，中试都将数据进行归纳整合，分析项目进行过程中所产生的问题。在此菌菌向老师请教了具体事例来进行分析，例如：一个实验项目中小试工艺中的发酵使用的培养容器一般是量筒，量少且精确度高；但在商业化生产中因为物料量大，常使用称重的方式进行称量，然后再进行溶液配制。因为物料量大，发酵中可能会产生一系列小试工艺中不曾出现的问题，即需要中试放大在一批批工艺试验中发现问题，积累数据，然后解决问题。

　　综上所述，中试放大的重要性可用八个字来概括“求同存异，数据积累”。将小试工艺和商业化生产当中皆可使用的工艺流程进行验证保留，不可进行放大生产的工艺进行修订直至符合商业化生产的要求；在每一批项目中对数据进行归纳整理并留取样品，方便之后的商业化生产中出现问题时可及时找出原因。

　　接下来菌菌带领大家看看中试放大过程中发酵部分的流程。在中试放大中我们常会使用到经验放大的研究方法，主要流程是通过逐级放大来摸索反应器的特征，实现从实验室装置到中间装置、中型装置和大型装置的过渡。

　　微生物工艺中通常使用大肠杆菌作为菌种，是市面上较为成熟的工艺开发菌种。广义上来说，现代发酵工程由三部分组成：上游工程、中游工程和下游工程。

　　在我们进入实验室前，我们需要穿上下分体式洁净服，佩戴一次性帽子、口罩、手套，进入实验室前使用酒精消毒，中试放大的实验室环境一般为D级洁净区。在正式实验之前，我们应该首先确定工艺文件的内容是否符合要求，核查记录与方案的内容是否一致，是否存在漏写或者二者在关键工艺上的不同。在核查完工艺文件后，再根据工艺文件对所需要的物料（厂家、货号一致）、仪器、耗材进行核查，进行物料的申领。然后使用天平进行物料称量，进行培养基的配制。培养基一般有固体培养基和液体培养基，固体常为琼脂培养皿，液体培养基中常见成分为蛋白胨加酵母粉，培养基中一般会加入抗生素进行菌株筛选。星耀小TIP：在此菌菌想给一个小贴士：固体培养基的配置与普通培养基相同，均是先称料、溶解、灭菌。与普通培养基不同的是，固体培养基在灭菌冷却时，不可直接冷却至室温，应在冷却至60 ℃左右时，加入抗生素并震荡均匀（若在较高温度下加入抗生素，容易使抗生素失活，如果加入温度过低，容易使固体培养基凝固，不方便转移）。

　　打开皿盖，使开口角小于30 °，靠近点燃酒精灯。右手倾倒固体培养基（液体），注意瓶口不可与培养皿接触。制备固体培养基时应该注意减少左手的抖动以避免固体培养基有气泡产生。待培养基完全覆盖培养皿底部时停止倾倒，合上培养皿盖子并轻轻放在生物柜实验台上。菌菌整理收纳了关于中试生产流程的一些资料，如有需要可后台私信菌菌进行领取噢~

　　目前耀海生物具备提供从原始库到工作库的建立的服务能力，RCB建库的法规要求“建立RCB需保证可溯源性，GMP体系下生产对RCB来说为非必须条件，而MCB和WCB必须在GMP车间内完成”，而耀海生物拥有成熟的RCB建库环境和有独立的GMP级别菌种建库车间，以及同时具备GMP体系生产条件。可避免多品种运行时的交叉污染，以及在同时服务多条管线时，有独立的GMP级别菌种建库车间可以不受车间服务排产的影响。

　　星耀小TIP：蛋白胨常应用于微生物和动物细胞培养基，外观以淡黄至棕粉剂为主。目前蛋白胨的来源主要为动物性蛋白胨和植物性蛋白胨。但由于动物源蛋白胨不顺应生态环境的可持续发展，以及动物源蛋白胨的成分复杂，追溯困难，国际上FDA和药典中心呼吁使用植物源蛋白胨代替动物源蛋白胨进行生物制品的制作。

　　将灭菌后的菌种复苏培养基置于生物安全柜中，开启紫外灯照射三十分钟，我们使用中的安全柜一般都是254 nm波长的紫外线 nm的紫外可以进行有效的杀灭细胞类的细菌或者病毒。然后在火焰保护下像菌种复苏培养基中加入抗生素，该操作的目的是保证菌液始终保持在无菌条件下进行。所有灭菌程序，以杀灭芽孢为标准。再将所需的工作菌种接种到培养基中，进行恒温摇床培养。星耀小TIP：芽孢又称内生孢子，是细菌休眠体。产芽孢细菌在营养条件缺乏时，在菌体内形成圆形或椭圆形的芽孢休眠体。芽孢含水量极低,抗逆性强，能经受高温、紫外线，电离辐射以及多种化学物质灭杀等，在灭菌监测中，可利用芽孢的高抗逆性制备生物指示剂。

　　在中试放大生产过程中，种子液一般取从小试工艺中的种子进行发酵生产，故在此不过多赘述。如对种子液培养相关情况不够了解可后台私信菌菌获取资料噢~

　　在开始发酵前，我们需要对实验室进行消毒，为防止发酵中的杂菌和噬菌体产生。车间消毒液主要为75%的酒精，苯扎溴铵溶液。苯扎溴铵是一种消毒杀菌剂，在使用后能够有效的改变细胞的通透性，使细胞的物质渗出能阻止代谢，能起到很好的杀菌作用。

　　耀海生物拥有GMP环境的车间，即整洁的生产环境，厂区的地面、路面及运输等不会对制品的生产造成污染，生产、行政、生活和辅助区的总体布局合理，厂区和厂房内的人、物流走向应当合理。耀海生物厂房所处的环境能够尽量降低物料或产品遭受污染。

　　在发酵罐灭菌前发酵罐pH计的标定校准，一般采用两点校准法，用pH4.00和Ph6.86的标准缓冲液对pH电极进行校准。然后将配制好的发酵液放置于发酵罐中。一般来说，一般来说pH标准液要定期更换（1周更换一次，开封后的标准液保质期为3个月）。且发酵液体积一般为发酵罐体积的1/2左右，保证罐内有充足的溶氧和后续可加入补料的条件。

　　发酵罐培养基配制完毕后进行定容，发酵罐检验底阀是否关闭，确认底阀关闭后将发酵罐培养液加入（根据发酵液具体情况判断）发酵罐中。待pH稳定且种子培养达到目标OD600值的时候，进行发酵罐接种，用酒精棉擦拭接种位置，在火焰保护下接种，然后将一级发酵液全部倒入发酵罐中，接种完毕后运行发酵罐发酵程序。

　　发酵过程中时刻注意发酵罐仪表盘上的参数情况，温度使用机器自控温度，溶氧根据实验具体需要进行控制，留意发酵罐内情况，每小时进行一次取样，取得的样品放入分光光度计中进行OD600值的测量并记录参数。当OD600值达到实验目的时进行下罐处理，进行菌液的收集。

　　从实验室工艺到工业生产，中试放大是必不可少的过程。中试放大一方面验证和完善实验室工艺（亦称小试）所确定的反应条件，另一方面研究确定工业化生产所需设备的结构、材质、安装以及车间布局等。通过中试放大，不仅可以得到先进、合理的生产工艺，而且获得较确切的消耗定额，为物料平衡、能量平衡、设备设计以及生产管理提供必要的数据。

　　那么关于中试放大发酵工艺的注意事项和具体操作流程，菌菌今天就跟大家分享到这里啦，如果读者还有其他疑惑的话可以后台私信菌菌噢~下一篇菌菌将带领大家了解关于中试放大纯化工艺的职责分解、实施及履行内容。

　　耀海生物服务覆盖 “重组蛋白/疫苗，质粒/mRNA、纳米抗体”等领域pre-IND至临床Ⅲ期样品制备及商业化生产服务，致力于打造CRO/CDMO/MAH全方位，定制化一站式服务平台。拥有20000平符合GMP要求车间，3000平研发中心，针对客户需求提供50L-2000L定制化服务。相关资讯请联系官方客服耀菌君联系：（微信同号）

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